數(shù)字PCR（Digital PCR）是一種基于單分子水平的PCR擴增技術，旨在準確測量目標分子的數(shù)量。相對于傳統(tǒng)的定量PCR技術，dPCR通過將PCR反應混合物分割成更小的單元，使每個單元中只有一個目標分子，從而提高了準確性和靈敏度。下面是dPCR技術的詳細解釋：

樣品分割：

dPCR將PCR反應混合物分割成許多小區(qū)域（例如微滴、陣列或芯片孔），使每個區(qū)域中只有一個目標分子或沒有目標分子。這種樣品分割使每個分割區(qū)域的PCR反應相互獨立，消除了反應競爭的影響。

擴增：

在每個樣品分割區(qū)域中，PCR反應通過加入引物、酶和核苷酸等組分進行擴增。擴增可以使用傳統(tǒng)的PCR方法，例如熱循環(huán)PCR（thermal cycling PCR）或滾環(huán)擴增（rolling circle amplification）等。關鍵的一點是，擴增過程中的分子數(shù)目是已知的，因為每個分割區(qū)域只有一個目標分子或沒有目標分子。

信號檢測：

為了確定每個分割區(qū)域是否含有目標分子，通常會使用熒光標記或探針來檢測PCR產物的存在與否。熒光信號可以通過熒光顯微鏡或熒光檢測設備進行測量。根據信號的有無，可以將每個分割區(qū)域標記為陽性（含有目標分子）或陰性（不含目標分子）。

數(shù)據分析：

通過統(tǒng)計每個分割區(qū)域的陽性和陰性數(shù)量，可以計算出目標分子的絕對數(shù)量。這通常使用Poisson分布模型進行計算。通過測量多個分割區(qū)域的結果，可以獲得更準確的目標分子數(shù)量，并估計其濃度。

dPCR技術的優(yōu)點：

更高的靈敏度：dPCR可以檢測極低豐度的目標分子，即使在稀有突變或低拷貝數(shù)的情況下也能準確測量。

更高的準確性：由于每個分割區(qū)域是獨立擴增和檢測的，dPCR對抑制物的影響較小，結果更可靠。

更寬的動態(tài)范圍：dPCR具有較廣的線性范圍，可以檢測從低拷貝數(shù)到高拷貝數(shù)的目標分子。

無需標準曲線：與定量PCR不同，dPCR不需要依賴外部標準曲線，而是直接計數(shù)目標分子的存在與否。

dPCR技術的應用：

突變檢測：dPCR可以檢測罕見突變，用于腫瘤早期診斷、監(jiān)測病毒突變等。

基因表達分析：dPCR能夠準確測量不同基因的表達水平，并檢測低豐度的轉錄變異。

病原體檢測：dPCR的高靈敏度和準確性使其成為檢測感染病原體的理想工具。

遺傳疾病篩查：dPCR可用于檢測染色體異常、單基因疾病等遺傳疾病的診斷和篩查。

總結：

數(shù)字PCR（dPCR）是一種利用樣品分割和單分子擴增的技術，能夠準確測量目標分子的數(shù)量。它具有高靈敏度、準確性和寬動態(tài)范圍等優(yōu)點，被廣泛應用于各個領域的分子生物學研究和診斷中。