問：在用qEP做支原體檢測(cè)的時(shí)候，加入內(nèi)控對(duì)照品，在儀器設(shè)置上是需要選擇兩個(gè)通道嗎？

答：是需要2個(gè)通道，一個(gè)FAM, 一個(gè)HEX，HEX是對(duì)應(yīng)內(nèi)控的通道。

問：我想問一下，7500儀器里面沒有HEX這個(gè)通道選項(xiàng)，可以用哪個(gè)通道代替呢？

答：7500這款是沒有HEX熒光標(biāo)識(shí)，不過(guò)問過(guò)廠家，說(shuō)7500有VIC，可以用VIC通道。

問：qPCR結(jié)果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中這個(gè)不相關(guān)是具體指什么？

答：這個(gè)不相關(guān)是指如果FAM是陽(yáng)性，那么由于擴(kuò)增時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，所以內(nèi)控是否有擴(kuò)增，其無(wú)關(guān)緊要。

問：在用樣品制備試劑盒時(shí)，進(jìn)行支原體DNA提取時(shí)，加入內(nèi)控對(duì)照品，實(shí)際上是監(jiān)控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA，而無(wú)法監(jiān)測(cè)這步操作的回收率的，是嗎？

答：“實(shí)際上是監(jiān)控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA”，可以這么理解，或者說(shuō)是在監(jiān)測(cè)整個(gè)提取過(guò)程。我們又問了一下廠家，內(nèi)控和樣品的提取效率是一樣的，這樣可以反映樣品的真實(shí)情況，因?yàn)橹灰獌?nèi)控提取后能測(cè)出來(lái)，那就表明提取是沒有問題的。極少量的支原體如10CFU的，通過(guò)提取，也是可以檢測(cè)到的，表明靈敏度是沒有問題的。樣本Ct值和10CFU的Ct值比較，是可以進(jìn)行相對(duì)定量的。

問：你們好，我問一下你們這個(gè)Venor Gem qEP試劑盒能做放行檢測(cè)嗎?

答：放行應(yīng)相當(dāng)于國(guó)外說(shuō)的release testing, 這個(gè)qEP試劑盒是符合國(guó)外藥典規(guī)定的性能，能做放行檢測(cè)的。同時(shí)需注意要做支原體DNA抽提才行，抽提是用另外一個(gè)盒子，見廠家的venor gem sample preparation kit。

問：這個(gè)如果是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？

答：只要是跟藥典有關(guān)，跟臨床治療或制藥檢驗(yàn)有關(guān)，就需要提取DNA。如果僅僅是科研用培養(yǎng)細(xì)胞，篩查支原體，則可以不提。

問：詢問qPCR儀器的設(shè)置

答：具體可見MB廠家文件Venor^®GeM qEP: Cyclers Programming，可從網(wǎng)站上下載。

問：被動(dòng)參比染料是選“none”吧？

答：對(duì)，沒有ROX，選none

問：大家好，想咨詢一下，咱們支原體DNA提取時(shí)所取的樣本量是依據(jù)什么定的呢，比如，我們有CAR-T細(xì)胞，病毒液等，如果CAR-T細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)來(lái)的話取多少細(xì)胞數(shù)比較好，或者如果病毒液按體積的話多少體積更佳呢？

答：支原體 DNA 提取試劑盒可從多含有 1X 10⁶細(xì)胞/ml 的細(xì)胞上清中直接分離 DNA，病毒沒有要求?？傮w積多 200μl。提取的樣本就是細(xì)胞上清，ATMPs（高級(jí)醫(yī)用藥品），細(xì)胞培養(yǎng)基等。病毒液應(yīng)該也是初來(lái)自細(xì)胞上清吧。樣本量是根據(jù)支原體污染量得出的經(jīng)驗(yàn)值，跟核酸純化柱上的DNA膜吸附能力有關(guān)。

問：病毒液就是類似細(xì)胞上清的。如果體積大于200ul的話我們可以濃縮，但是這個(gè)體積有沒有一個(gè)上限呢？

答：體積有上限，是200 to 1000 µl, 可以參看經(jīng)典法試劑盒的那個(gè)說(shuō)明書里對(duì)樣本處理那一塊。這個(gè)樣本量同時(shí)還考慮了靈敏度，使檢測(cè)達(dá)到很好的靈敏度。如果細(xì)胞數(shù)高于1X 10⁶細(xì)胞/ml ，那必須要先調(diào)細(xì)胞數(shù)了?；蛘邷p少樣本體積，總細(xì)胞數(shù)不超，也行。

問：您好，我這邊要提取10cfu對(duì)照品的基因組，10cfu對(duì)照品的說(shuō)明書寫著用1ml基質(zhì)重懸，基因提取試劑盒說(shuō)一次上樣200μl進(jìn)行提取，想問您一下，用200μl基質(zhì)重懸10cfu可以嗎，想一次提完。

答：還是建議用1ml的基質(zhì)重懸，因?yàn)殪`敏度是以10CFU/ml為單位的。如果用200ul，濃度就高了。廠家建議10CFU標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶了以后，要立即用完，不要再保存，擔(dān)心可能降解。

問：那1ml溶解的標(biāo)準(zhǔn)品，按提取試劑盒的要求，就得用多個(gè)管子一次提完對(duì)吧？

答：是的。

問：這個(gè)抽提試劑盒的收率有多少，是磁珠還是吸附柱？吸附柱的收率能有，因?yàn)橐郧拔覀冇闷渌放频某樘嵩噭┖?，收率只有百分之六，這樣的話，就存在假陰性結(jié)果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取試劑盒的COA里，用的是很少量的支原體10CFU/ml，提取DNA后都可以檢測(cè)到。廠家來(lái)信說(shuō)，產(chǎn)率依賴于DNA的類型（如GC含量，是基因組還是質(zhì)粒）、操作者的技巧以及樣本基質(zhì)的情況。因?yàn)檫@些情況，操作者很難達(dá)到生產(chǎn)商所給的比率，從而形成各種討論，因此產(chǎn)率沒寫到說(shuō)明書里。

問：要檢測(cè)支原體的培養(yǎng)基中有酚紅，是否還需要抽提？

答：只要是在25ulPCR體系中加入的樣本量≤2ul，酚紅就不會(huì)對(duì)qPCR構(gòu)成問題。更高濃度的酚紅會(huì)引起基線偏移，造成靈敏度降低。如果僅僅是篩查，則不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的產(chǎn)品放行檢查，則需要抽提了。細(xì)胞基質(zhì)的驗(yàn)證總是要做的。

問：做qPCR，一個(gè)陰性對(duì)照Ct約為40，也有擴(kuò)增曲線。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于產(chǎn)生非特異性信號(hào)（如primer artefacts）以及極微小的污染所致。 但是，該結(jié)果是不具有可重復(fù)性的，因此結(jié)果仍然是陰性。

問：一步法的盒子的靈敏度是否總低于經(jīng)典法試劑盒？有沒有可能一步法的盒子也能檢測(cè)10CFU？

答：廠家回復(fù)如下：意思是一步法的樣本量為2ul用于支原體篩查，經(jīng)典法為10ul，用于產(chǎn)品的放行檢測(cè)。檢測(cè)10CFU的標(biāo)準(zhǔn)品非常具有挑戰(zhàn)性。一步法因?yàn)闃颖玖坎粔?，很難達(dá)到10CFU/ml。如果客戶想要包含DNA聚合酶的PCR試劑盒，可以選擇VenorGeM Classic G型試劑盒。它和經(jīng)典法（不含酶）的交叉驗(yàn)證確實(shí)做過(guò)，顯示同樣的靈敏度。但全套的驗(yàn)證沒有做過(guò)。

問：支原體10cfu標(biāo)準(zhǔn)品是干粉吧？ 配完后是多少體積？

答：是凍干粉，加基質(zhì)液后是1ML體積。

問：基質(zhì)液產(chǎn)品里帶嗎？

答：這個(gè)產(chǎn)品里不帶，是客戶自己要檢測(cè)哪類樣品，就用樣品里的基質(zhì)液（例如用的哪個(gè)培養(yǎng)基）

問：PCR經(jīng)典法，跑膠時(shí)體現(xiàn)1條陽(yáng)性帶，是否代表PCR經(jīng)典法可以檢測(cè)多種支原體，無(wú)法區(qū)分支原體種類。

答：PCR經(jīng)典法，跑膠時(shí)為1條陽(yáng)性帶，無(wú)法區(qū)分支原體種類，需要將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序鑒定。